F-box 蛋白是最大的調(diào)節(jié)蛋白家族之一，在蛋白質(zhì)降解中起重要作用。在植物中，F(xiàn) 蛋白在功能上非常多樣化，只有一小部分被詳細(xì)表征。本文鑒定了一種新型 F-box 蛋白 FBX92 作為擬南芥葉片生長的抑制劑。AtFBX92 的過度表達(dá)導(dǎo)致植物的葉子比野生型小，而AtFBX92水平降低的植物則通過刺激細(xì)胞增殖而增加葉片生長。詳細(xì)的細(xì)胞分析表明，AtFBX92 特別影響早期葉片發(fā)育過程中的細(xì)胞分裂速率。AtFBX92水平降低的植物中幾個細(xì)胞周期基因表達(dá)水平的增加支持了這一點。而玉米同源基因ZmFBX92 在玉米中的過表達(dá)對植物生長沒有影響，而擬南芥中的異位表達(dá)增加了葉子的生長。截斷形式的 AtFBX92 的表達(dá)表明，ZmFBX92和AtFBX92在擬南芥中功能增益的對比效應(yīng)是由于ZmFBX92基因中缺少F-box相關(guān)結(jié)構(gòu)域。我們的工作揭示了復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的另一個參與者，它決定了葉子的大小并為識別假定的底物奠定了基礎(chǔ)。

ZmFBX92OE和WT植物的表型分析顯示，轉(zhuǎn)基因植物的葉面積顯著較大，其他表型正常（圖1）。在標(biāo)準(zhǔn)和輕度滲透脅迫條件下體外生長的WT和ZmFBX92OE植株的預(yù)計花環(huán)面積（PRA）在分層后6天至21天（DAS）確定（圖1A）。平均而言，脅迫在21 DAS 時使花環(huán)面積減少了約 60%。在兩種條件下，ZmFBX92OE 植物與WT相比具有顯著增加的花環(huán)面積（圖1A）。ZmFBX92OE 對擬南芥葉片大小的積極影響通過確定22 DAS時的單個葉面積得到證實（圖1B、C）。ZmFBX92OE 植物的成熟葉和幼葉都較大。為了檢查細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞擴增的差異在多大程度上導(dǎo)致葉片尺寸增加，在WT和ZmFBX92OE葉片中比較了背面表皮細(xì)胞的數(shù)量和尺寸。ZmFBX92OE 植物中*成熟（22DAS）的第三片葉子由于細(xì)胞數(shù)量的高度增加（約70%）而增大了約30%，這部分被細(xì)胞大小減少約20%（圖1D）所補償。因此，ZmFBX92 在擬南芥中的異位表達(dá)導(dǎo)致葉片變大，主要是由于細(xì)胞數(shù)量增加。

與異位表達(dá)ZmFBX92的植物所觀察到的相反，與WT植物相比，AtFBX92OE 植物的花環(huán)面積減少（圖 2A）。這種減少在輕度滲透脅迫下相當(dāng)。在AtFBX92OE植物中沒有觀察到其他明顯的表型。從6個DAS開始，在發(fā)育的早期就已經(jīng)可以看到減小的花環(huán)大小（圖 2A）。AtFBX92過表達(dá)對葉生長的負(fù)面影響通過測定體外生長的 22 天齡植物的單個葉面積得到證實。與WT相比，AtFBX92OE7植物的成熟葉面積顯著較小，而對于AtFBX92OE2 植物，所有葉子都顯著較小，包括幼葉（圖2B、C）。為了探索葉片尺寸減小的細(xì)胞基礎(chǔ)，在細(xì)胞水平上分析了體外生長的 AtFBX92OE 和WT植物的葉片發(fā)育。與ZmFBX92OE的情況類似，第三片葉子背面表皮的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞大小在21 DAS時確定，此時這片葉子*成熟（圖2D）。AtFBX92OE2和AtFBX92OE7的成熟第三葉分別比WT小45%和16%，這是由于細(xì)胞數(shù)量大幅減少，部分補償通過增加的單元尺寸。

圖1.（左圖）ZmFBX92表達(dá)對擬南芥花環(huán)和葉片生長的影響以及葉片大小差異的細(xì)胞基礎(chǔ)

圖2.（右圖）在標(biāo)準(zhǔn)體外條件下AtFBX92異位表達(dá)對花環(huán)和葉片生長的影響以及葉片大小差異的細(xì)胞基礎(chǔ)

圖3.（左圖）體外標(biāo)準(zhǔn)條件下AtFBX92 下調(diào)對花環(huán)和葉片生長的影響以及葉片大小差異的細(xì)胞基礎(chǔ)

圖4.（右圖）體外標(biāo)準(zhǔn)條件下AtFBX92del 表達(dá)對花環(huán)和葉片生長的影響以及葉片大小差異的細(xì)胞基礎(chǔ)

與過度表達(dá)AtFBX92的植物平行，通過使用以下工具設(shè)計靶向AtFBX92的人microRNA（amiRNA），產(chǎn)生表達(dá)水平降低的轉(zhuǎn)基因植物。對三個表達(dá)水平降低的純合、獨立、單基因座系的葉片表型進(jìn)行了分析，由于它們非常相似，因此僅給出了amiFBX92-4（以下稱為amiFBX92）的結(jié)果（圖3。從DAS的第5天到第21天測定PRA，并顯示amiFBX92中的PRA比分析第一天起的WT更大（圖3A）。在輕度滲透脅迫下，PRA的增加具有可比性。接下來，在21 DAS測定單個葉面積。除amiFBX92的葉片3外，所有葉片均顯著大于WT的葉片（圖3B，C）。21 DAS時*成熟的第一對葉的細(xì)胞分析表明，葉面積的（24%）是由于細(xì)胞數(shù)量增加（47%），部分由細(xì)胞大小減小（16%）補償（圖3D）。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明改變AtFBX92表達(dá)水平以相反的方式影響葉片大小，這主要是細(xì)胞數(shù)量差異的結(jié)果。

PRA 隨時間的定量圖像分析，從 6 DAS 到 24 DAS，表明 AtFBX92del 植物比 WT 大（圖 4A）。 此外，PRA 增加在發(fā)育過程中很早就開始（圖 4A），類似于ZmFBX92OE 和 amiFBX92 品系中觀察到的效果。與此一致，在 20 DAS 確定的單個葉面積顯著大于 WT（圖 4B、C）。 一致地，在 20 DAS 時第一對葉的大小增加（27%）是由于細(xì)胞數(shù)量增加（29%），而對細(xì)胞大小沒有顯著影響（圖 4D）。

圖5.在標(biāo)準(zhǔn)和干旱脅迫條件下，AtFBX92錯誤表達(dá)對土壤中生長的植物葉片大小的影響

為了驗證在體外觀察到的AtFBX92表達(dá)水平改變的植物花環(huán)大小的差異，在自動成像平臺 WIWAM 上的土壤中種植了AtFBX92OE、amiFBX92、AtFBX92del和相應(yīng)的WT植物。分析了每個構(gòu)建體的兩條線。本文也可以證實，在土壤中AtFBX92OE植物比WT小，而amiFBX92和AtFBX92del植物更大，盡管對于AtFBX92del植物這只能在兩條線之一中得到證實（圖 5A）一般來說，土壤中的影響似乎不如體外顯著，因為與WT的絕對百分比差異在體外總是大于在土壤中。通過向培養(yǎng)基中添加甘露醇，在滲透脅迫條件下生長的 AtFBX92OE和amiFBX92植物PRA減少與在這些條件下生長的WT植物的PRA減少沒有顯著差異。向生長培養(yǎng)基中添加甘露醇通常在實驗室環(huán)境中用作滲透脅迫的代表。由于土壤種植植物的反應(yīng)更接近自然條件，還評估了輕度干旱脅迫對AtFBX92水平改變的土壤種植植物和WT植物的影響（圖 5B）。