Transcriptome analysis of Pinus halepensis under drought stress and during recovery

干旱脅迫下黑松恢復(fù)期的轉(zhuǎn)錄組分析

林木利用各種策略來應(yīng)對(duì)干旱脅迫，這些策略涉及復(fù)雜的分子機(jī)制。黑松分布于整個(gè)地中海盆地，是最耐旱的松種之一。為了破譯黑松用來抵御干旱的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了大規(guī)模的生理和轉(zhuǎn)錄組分析。本文從一個(gè)生長(zhǎng)條件不理想的半干旱地區(qū)選擇了一棵成熟的樹木進(jìn)行扦插繁殖。然后使用高通量實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)整個(gè)植物的蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和VPD。在氣孔前反應(yīng)、部分氣孔關(guān)閉、最小蒸騰、灌水后、部分恢復(fù)和*恢復(fù)六個(gè)生理階段對(duì)植物的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了檢測(cè)。在每個(gè)階段，將暴露于干旱處理的植物的數(shù)據(jù)與從灌溉良好的對(duì)照植物收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。干旱脅迫下的黑松轉(zhuǎn)錄組是使用雙端 RNA-seq 創(chuàng)建的。在經(jīng)過干旱處理的樹木和對(duì)照樹木之間，總共鑒定出約6000個(gè)差異表達(dá)的非冗余轉(zhuǎn)錄本。聚類分析揭示了與光合作用、活性氧 (ROS) 通過抗壞血酸 (AsA) 循環(huán)清除、脂肪酸和細(xì)胞壁生物合成、氣孔活性以及類黃酮和萜類化合物的生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物的應(yīng)激誘導(dǎo)下調(diào)。上調(diào)的過程包括葉綠素降解、通過AsA非依賴性硫醇介導(dǎo)的途徑清除活性氧、脫落酸反應(yīng)和熱休克蛋白、thaumatin和exordium的積累。干旱恢復(fù)誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)轉(zhuǎn)座子1-94。干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄組闡明了該物種對(duì)干旱和恢復(fù)的動(dòng)態(tài)反應(yīng)，并揭示了新的機(jī)制。

圖1.干旱和恢復(fù)過程中黑松全株蒸騰速率和冠層氣孔導(dǎo)度的變化

本文評(píng)估了在不同灌溉制度下生長(zhǎng)的植物的生理反應(yīng)。最初，對(duì)植物進(jìn)行7天的充分灌溉，然后暫停灌溉46天，以施加越來越大的脅迫壓力，然后恢復(fù)灌溉。監(jiān)測(cè)兩個(gè)主要參數(shù)以確定干旱嚴(yán)重程度：中午的E和中午的gsc。與停止灌溉19天后的對(duì)照植物相比，干旱處理導(dǎo)致第26天中午E和gsc顯著減少（圖1）。盡管圖1B中的E是五個(gè)重復(fù)的平均值，圖1C中的gsc是單個(gè)植物的，但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中E的模式與gsc的模式匹配，并且這兩個(gè)參數(shù)與VPD的每日變化相關(guān)（圖1）。隨著干旱的持續(xù)，干旱處理的樹木的gsc從第21天的319逐漸下降到第26天的171，并在干旱期結(jié)束時(shí)降至94 mmol s-1 g-1（圖1C）。恢復(fù)灌溉后，經(jīng)干旱處理的樹木的E和gsc恢復(fù)到干旱處理前記錄的水平，表明干旱處理并非結(jié)束。在gsc的基礎(chǔ)上，選擇了兩株干旱處理和兩株灌溉（對(duì)照）樹木，在六個(gè)不同生理階段進(jìn)行分子研究。選擇的轉(zhuǎn)錄組分析階段（圖1C）如下：（D1）第 21 天的氣孔前反應(yīng)，319 gsc；(D2) 第27天氣孔部分關(guān)閉，171gsc；(D3) 第 53 天的最小蒸騰作用，94 gsc；(D4) 在第54天用116gsc 灌溉后；(D5) 在第56天部分恢復(fù)，271gsc； (D6) 在第69天*恢復(fù)，gsc為523mmol s-1g-1。

圖2.響應(yīng)干旱和恢復(fù)的差異表達(dá)（DE）轉(zhuǎn)錄本

在上述六個(gè)生理階段對(duì)干旱處理和對(duì)照樹木的基因表達(dá)譜分析使我們能夠分析在干旱處理植物和對(duì)照植物之間差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本（圖2）。一般來說，隨著干旱的進(jìn)展，DE轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量逐漸增加，在恢復(fù)過程中逐漸減少。轉(zhuǎn)錄下調(diào)在干旱響應(yīng)中占主導(dǎo)地位，而在重新澆水和整個(gè)恢復(fù)期間，轉(zhuǎn)錄上調(diào)占主導(dǎo)地位（圖2）。在 D1 階段的干旱處理和對(duì)照克隆中僅鑒定出 27 個(gè)上調(diào)和 27 個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。與在 D2 階段收集的生理數(shù)據(jù)一致，此時(shí)注意到 gsc 減少（圖2B），223個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，而370個(gè)轉(zhuǎn)錄本下調(diào)。在D3階段，在觀察到的蒸騰速率和gsc時(shí)（圖1B和3B），注意到878個(gè)轉(zhuǎn)錄本的上調(diào)和1490個(gè)轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)。再澆水幾個(gè)小時(shí)后，在D4階段，2071個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，而1505個(gè)轉(zhuǎn)錄本下調(diào)。這些數(shù)字在D5階段（部分恢復(fù)）減少到537個(gè)上調(diào)轉(zhuǎn)錄本和510個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。上調(diào)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量在 D6 階段（*恢復(fù)）急劇增加至1275，而此時(shí)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量已下降至336（圖 2A）。總共發(fā)現(xiàn)黑松轉(zhuǎn)錄組包含 6035個(gè)DE轉(zhuǎn)錄本，其中2466個(gè)先前報(bào)道過，3567個(gè)是從頭組裝的。轉(zhuǎn)錄組包括1035 (17%) 個(gè)無注釋的重疊群和 650 (10.1%) 個(gè)與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件相關(guān)的重疊群。為了識(shí)別不同生理階段常見的轉(zhuǎn)錄本，分別為D2-D6階段的上調(diào)和下調(diào)轉(zhuǎn)錄本生成了兩個(gè)維恩圖（圖2C和D）。下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的最高重疊在階段D3和D4之間，這表明 >50% 的常見轉(zhuǎn)錄本表明重新澆水后逐漸恢復(fù)。上調(diào)轉(zhuǎn)錄物的最高重疊D4和D6之間，其中大多數(shù)是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。上調(diào)轉(zhuǎn)錄本的第二高重疊在D3和D4之間，表明重新澆水后逐漸恢復(fù)。

圖3.干旱和恢復(fù)期間黑松中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達(dá)模式

集群20主要由在D4和D6階段上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本主導(dǎo)。該集群包括1405個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中646個(gè)轉(zhuǎn)錄本沒有注釋。該集群還包括與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)的489個(gè)轉(zhuǎn)錄本。這些誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子屬于HAT、Ty1、Ty3 和Tf2家族（圖6）。然而，具有243個(gè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的最主要的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是1-94（圖6B 和C）。在該簇的其余275個(gè)轉(zhuǎn)錄本中，8個(gè)是TF，44個(gè)與光合作用相關(guān)，22個(gè)過氧化物酶-64轉(zhuǎn)錄本，18個(gè)核糖核酸酶 (RNase) H轉(zhuǎn)錄本和10個(gè)內(nèi)切核糖核酸酶切丁酶轉(zhuǎn)錄本。在簇6和27中看到了28個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的類似模式，它們總共包括130個(gè)轉(zhuǎn)錄本。